Module D – Subculture Techniques
เนื้อหาบทเรียน
1. ความหมายและความสำคัญของ Subculture
การ Subculture หรือ "การย้ายเนื้อเยื่อ" คือหัวใจสำคัญของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช หมายถึงกระบวนการย้ายชิ้นส่วนพืชจากอาหารเลี้ยงเดิมที่สารอาหารเริ่มหมดหรือสะสมของเสีย ไปยังอาหารเลี้ยงใหม่ที่ปลอดเชื้อ เพื่อกระตุ้นให้พืชเจริญเติบโตและขยายพันธุ์อย่างต่อเนื่อง
ทำไมถึงสำคัญ?
- รักษาสายพันธุ์: ช่วยให้พืชต้นเดิมสามารถขยายพันธุ์เพิ่มจำนวนได้เรื่อยๆ โดยไม่กลายพันธุ์
- กระตุ้นการเจริญเติบโต: การได้รับสารอาหารเข้มข้นใหม่ช่วยกระตุ้นการแตกยอดหรือราก
- ป้องกันการตาย: หากปล่อยไว้นานเกินไป เนื้อเยื่อจะขาดอาหารและสะสมสารพิษ (เช่น Phenolic compounds) จนตายได้
2. ช่วงเวลาที่เหมาะสมในการทำ Subculture
การสังเกต "สัญญาณ" จากพืชเป็นทักษะที่สำคัญ โดยทั่วไปควรทำ Subculture ทุกๆ 4-8 สัปดาห์ ขึ้นอยู่กับชนิดพืชและอัตราการเจริญเติบโต
สัญญาณเตือนที่ต้องย้าย
- อาหารเปลี่ยนสี: อาหารวุ้นเริ่มเหลืองคล้ำ หรือมีสีน้ำตาลซึมออกมา (Browning)
- อาหารแห้งยุบ: วุ้นเริ่มร่อนออกจากขวด หรือปริมาณลดลงอย่างเห็นได้ชัด
- พืชโตเต็มขวด: ใบหรือยอดเริ่มชนฝาขวด หรือรากแน่นจนไม่มีที่ว่าง
- พืชเริ่มเหลือง: แสดงอาการขาดธาตุอาหาร (Deficiency symptoms)
3. ขั้นตอนและเทคนิคการ Subculture
- เตรียมความพร้อม: นำขวดพืชและอาหารใหม่เข้าตู้ Laminar Flow ที่เปิด UV ฆ่าเชื้อแล้ว 15-30 นาที
- ฆ่าเชื้ออุปกรณ์: จุ่มปากคีบและมีดผ่าตัดในแอลกอฮอล์ 95% แล้วลนไฟให้แดง พักให้เย็นสักครู่
- การคีบพืช: เปิดฝาขวด ลนไฟปากขวด คีบกอพืชออกมาวางบนจานเพาะเชื้อ (Petri dish) ที่ปลอดเชื้อ
- การตัดแต่ง: ตัดใบแก่หรือเนื้อเยื่อที่ตายออก แยกกอพืชออกเป็นชิ้นส่วนเล็กๆ ตามต้องการ (เช่น ยอดเดี่ยว)
- การย้ายลงอาหารใหม่: คีบชิ้นส่วนพืชปักลงในอาหารใหม่ ลนไฟปากขวดใหม่ก่อนปิดฝาให้สนิท
- ซีลฝา: ใช้พลาสติกแรป (Parafilm) พันรอบฝาเพื่อป้องกันเชื้อและมด
วิดีโอ: เทคนิคการ Subculture
4. การเลือกอาหารเลี้ยงและฮอร์โมนพืช
- ระยะเพิ่มปริมาณ (Multiplication): นิยมใช้สูตรที่มี Cytokinin สูง (เช่น BA, Kinetin) เพื่อกระตุ้นการแตกยอด
- ระยะออกราก (Rooting): นิยมใช้สูตรที่มี Auxin สูง (เช่น NAA, IBA) เพื่อกระตุ้นการสร้างราก
- สูตรมาตรฐาน: MS (Murashige and Skoog) เป็นสูตรพื้นฐานที่ใช้ได้กับพืชส่วนใหญ่
5. การป้องกันและจัดการการปนเปื้อน & ปัญหาที่พบบ่อย
การปนเปื้อน (Contamination)
หากพบเชื้อรา (เส้นใยสีขาว/เขียว/ดำ) หรือแบคทีเรีย (เมือกขุ่น) ให้นำขวดนั้นไปนึ่งฆ่าเชื้อทิ้งทันที ห้ามเปิดฝาในห้องแลบเด็ดขาด
การป้องกัน: ล้างมือ สวมหน้ากาก มัดผม และรักษาระดับมือไม่ให้ข้ามผ่านเหนืออุปกรณ์ที่ฆ่าเชื้อแล้ว
Vitrification (อาการฉ่ำน้ำ)
พืชมีลักษณะใส เปราะ ฉ่ำน้ำเหมือนแก้ว
→ เพิ่มวุ้น, ลด Cytokinin, ปรับอุณหภูมิ
Browning (เกิดสารสีน้ำตาล)
พืชหลั่งสารฟีนอลออกมาทำลายตัวเอง
→ ย้ายบ่อยขึ้น, เติมผงถ่าน (Activated Charcoal)
Learning Outcomes
- เข้าใจจังหวะเวลาที่ถูกต้องในการย้ายเนื้อเยื่อเพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด
- สามารถปฏิบัติการ Subculture ได้อย่างถูกต้องตามหลัก Aseptic technique
- แก้ไขปัญหาเบื้องต้น เช่น การปนเปื้อน หรืออาการผิดปกติของพืชได้